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主办单位:内蒙古自治区食品药品学会
编辑出版:北方药学编辑部
刊期:月刊
国内定价:每期12元 ,全年144元
创刊时间:2004年
国内统一刊号:CN15-1333/R
国际标准刊号:ISSN1672-8351
邮发代号:16-421

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实验研究
 
柴胡桂枝汤对SE大鼠IRE1、 CHOP蛋白表达的影响* 2011/6/11
   

                  柴胡桂枝汤对SE大鼠IRE1 CHOP蛋白表达的影响*

     王棕可 胡跃强 (广西中医学院 南宁  530001;广西中医学院第一临床医学院  南宁  530023

摘要:目的:观察柴胡桂枝汤对癫痫持续状态(status epilepticusSE)大鼠内质网应激IRE1信号转导通路前存活分子IRE1mRNA与前凋亡分子CHOP蛋白在大鼠海马区表达的变化及该区域神经元细胞凋亡情况。方法:采用氯化锂-匹罗卡品制作SE模型,将90SD大鼠随机分为对照组、SE组、药物组3组,每组按照SE2h4h8h24h72h五个时间点分为5个亚组。应用原位细胞凋亡检测法(TUNEL法)观察海马区神经元细胞凋亡数、用RT-PCR检测SE后海马IRE1mRNA的表达,用免疫组织化学法检测CHOP蛋白表达。结果:①SE872h时间点TUNEL阳性细胞数多于对照组(P<0.01),其阳性细胞数随惊厥持续时间延长而增加。药物组872h时间点TUNEL阳性细胞数较SE组明显减少(P<0.05)。②对照组IRE1mRNA有少量表达;SEIRE1mRNA的表达于SE4h表达量为最高,随后逐渐下调;其4h8h24h时间点较对照组有显著差异(P<0.01)。药物组4h6h24h时间点海马区IRE1mRNA的表达明显高于SE组,差异有显著性(P<0.05)。③对照组未见CHOP阳性细胞,SE组于2h后在海马区可见CHOP阳性细胞,随时间的延长阳性细胞数逐渐增多,于24h达到高峰,之后逐渐下降;SECHOP阳性细胞数与对照组比较,两者有显著差异(P<0.01)。药物组各个时间点CHOP数量表达明显少于SE组,两者有显著差异(P<0.01)。结论:柴胡桂枝汤可能通过减少SE对内质网的刺激,上调前存活分子IRE1的表达,下调前凋亡分子CHOP的表达,减轻异常放电对脑组织的病理损害,发挥对神经元的保护作用。

关键词:内质网应激  SE  柴胡桂枝汤  IRE1mRNA  CHOP

中图分类号:R285                文献标识码:B             文章编号:1672-8351201102-0063-03

    柴胡桂枝汤是治疗癫痫的有效方剂[1、2],但其作用机理有待阐明。本研究从内质网应激角度初步探讨加味柴胡桂枝汤治疗癫痫的机制,以期为其更好地应用于临床打下坚实的实验基础,同时也为临床癫痫的治疗靶点和防治用药提供依据。

1 实验材料

1.1实验动物 

    健康雄性SPFSD大鼠90只(由广西医科大学动物实验中心提供),16周龄,体重250±50g

1.2主要实验药品及试剂 

    氯化锂、匹罗卡品购于Sigma公司;硫酸阿托品注射液购于浙江瑞新药业股份公司;Trizol Reagent试剂为Invitrogen公司产品;RT-PCR试剂盒、CHOP抗体、SABC试剂盒及羊抗鼠IgG、原位细胞凋亡检测法(TUNEL)试剂盒均购于武汉博士德生物工程有限公司。柴胡桂枝汤(柴胡10g、人参10g、半夏10g、桂枝10g、白芍15g、姜黄10g、钩藤15g7味中药)单味中药浓缩颗粒剂由江苏省江阴天江药业有限公司制备;其浓度及等效剂量按人体表面积折算。

2 实验方法

2.1实验分组 

    健康雄性SPFSD大鼠90只,体重250±50g,随机分为3组:对照组(control)、SE模型组(SE)、柴胡桂枝汤干预组(药物组),每组30只。每组按照SE2h4h8h24h72h五个时间点平均分为5个亚组(n=6)。分别作如下处理:对照组以生理盐水代替匹罗卡品腹腔注射,余处理同SE组;SE组采用氯化锂—匹罗卡品大鼠癫痫持续状态(SE)模型,造模后2h4h8h24h72h处死大鼠;药物干预组大鼠造模前连续3d灌胃加味柴胡桂枝方颗粒溶液,每天上、下午各一次。造模后24h72h处死者每天追加给药1次,按规定时间点处死大鼠。

2.2动物模型及标本制备

    大鼠腹腔注射氯化锂3mEq/kg(约125mg/kg),18小时后腹腔注射硫酸阿托品注射液5mg/kg30min后腹腔注射匹罗卡品10mg/kg.次,若大鼠无痫性发作,则每隔30min追加注射匹罗卡品10mg/kg.次,直至动物出现痫性发作。大鼠分别于惊厥发作停止后4h12h24h72h依次断头取脑。石蜡包埋后用振荡切片机从视交叉处开始作冠状连续切片,片厚5μm,用于TUNEL染色与CHOP免疫组织化学检测分析。大脑右半球在无核糖核酸(RNA)酶的环境下冰盘内钝性分离海马,称重后即置于EP管中用作RT-PCR检测。

2.3TUNEL染色 

    常规烤片、脱腊、脱水,胰蛋白酶K400μg/mL室温15min 3%H2O2室温10min,封闭血清室温10minTUNEL反应液50μL(试剂1∶试剂2=11937℃孵育60minPOD(试剂350μL37℃孵育30minDAB显色1.5min,苏木素适度复染,常规水化、透明后中性树脂封片。阴性对照组用试剂2(不含TdT)代替TUNEL反应液。按试剂盒说明操作。

2.4RT-PCR检测IRE1mRNA含量 

    TRIzol提取总RNA,继之用M-MLV逆转录酶进行逆转录,按试剂盒说明操作。光密度法对RNA进行定量,1%含溴乙锭琼脂糖凝胶电泳检测RNA质量,以GAPDH作为内参物。引物序列:IRE1上游:5-GACGGACAGAATACACCATCAC-3;下游:5-CCACCACAGGAGAGGCATAG-3,产物长度345bdpPCR体系包括cDNA 3μL10×buffer2.5μLMgCl2 1.53μLdNTP0.5μLTaq0.2μL,上下游引物各0.8μL;总反应体系为25μLPCR扩增条件:95℃预变性5min94℃变性30s,退火30s72℃延伸40s35个循环,最后经72℃延长8min终止反应。IRE1退火温度50.0℃,GAPDH退火温度55.8℃。

2.5免疫组化法检测CHOP蛋白表达

    切片经室温晒干,0.3H2O2室温30min,正常山羊血清室温封闭20minCHOP抗体(11504℃冰箱内过夜,生物素化羊抗兔IgG 37 20minSABC 37 20min DAB显色5min,常规脱水、透明、封片。对照实验组用PBS代替CHOP抗体。

3 检测方法 

    原位凋亡检测每个标本在高倍镜下(日本Olympus公司)随机观察海马区凋亡阳性细胞数,每张切片测定4个视野(×400),取平均值作为测定值。IRE1mRNASmart View软件测定产物吸光度值,用目的条带吸光度值与内参条带吸光度值之比表示组织目的基因mRNA的含量。采用HPIAS-1000高清晰彩色病理图像分析系统对免疫组化切片进行图像分析,测定CHOP免疫组化染色的灰度值,染色越深,灰度值越小,蛋白表达越多。每张切片测定4个视野(×400),取平均值。

4 统计学方法

    用SPSS13.0统计软件分析,所得数据以均数±标准差(x±s)表示,多组样本均数比较采用单因素方差分析,均数的两两比较采用t检验,P<0.05示差异有显著性。

5  

5.1 TUNEL结果

    TUNEL染色结果显示,SE872h各时间点TUNEL阳性细胞数均多于对照组(P<0.01),且SETUNEL阳性细胞数随惊厥持续时间延长而增加。药物组872h时间点TUNEL阳性细胞数较SE组明显减少(P<0.05),见表1

                               表1 神经元凋亡的阳性细胞数

组别

n

时间点

F

P

2h

4h

8h

24h

72h

对照组

30

6.272±1.646

6.540±1.642

6.211±1.942

6.524±1.678

6.285±1.707

SE

30

5.826±2.661

5.085±2.531b

12.618±1.981 a e

20.001±2.562 a e

25.905±3.254 a e

353.513

P0. 01

药物组

30

6.534±1.045

5.203±0.865 a e

8.782±1.927 a c e

13.307±2.471 a c e

18.741±4.063a c e

163.083

P0. 01

F

1.057

5.965

81.990

263.892

295.547

P

P 0. 05

P < 0. 01

P < 0. 01

P < 0. 01

P < 0. 01

    与对照组比较,aP<0.01,与对照组比较bP<0.05c:SE组比较,P<0.01,与同组2h时间点比较eP<0.01

5.2 RT-PCR检测IRE1mRNA含量结果

    对照组各时间点IRE1mRNA均有少量表达;SEIRE1mRNA的表达于SE4h表达量为最高,随后逐渐下调;其4h8h24h时间点较对照组有显著差异(P<0.01)。药物组4h6h24h时间点海马区IRE1mRNA的表达明显高于SE组,差异有显著性(P<0.05),见表2

                            表2   各组IRE1mRNA的表达变化

组别

n

时间点

F

P

2h

4h

8h

24h

72h

对照组

30

0.485±0.058

0.489±0.048

0.479±0.068

0.498±0.059

0.481±0.051

SE

30

0.462±0.127

1.183±0.145 a e

0.922±0.138 a e

0.405±0.106 a

0.480±0.186

172.731

P < 0. 01

药物组

30

0.528±0.369

1.335±0.378 a e

1.336±0.100 a c e

0.841±0.058 a c e

0.449±0.040b

92.087

P < 0. 01

F

0.646

109.426

487.272

257.035

0.741

P

P 0. 05

P < 0. 01

P < 0. 01

P < 0. 01

P 0. 05

    与对照组比较aP<0.01,与对照组比较,bP<0.05,与SE组比较cP<0.01,与同组2h时间点比较eP<0.01

5.3 CHOP蛋白免疫组化验结果

    免疫组化及定量分析显示,CHOP蛋白免疫反应产物呈棕黄色,主要表达于细胞核,胞浆内有少量表达。对照组未见CHOP阳性细胞,SE组于2h后在海马区可见CHOP阳性细胞,随时间的延长阳性细胞数逐渐增多,于24h达到高峰(P<0.01),之后逐渐下降。药物组各个时间点CHOP数量表达明显少于SE组,两者有显著差异(P<0.01),见表3

                           表3   各组CHOP蛋白表达的平均灰度值

组别

n

时间点

F

P

2h

4h

8h

24h

72h

对照组

30

119.772±3.155

117.964±2.487

120.994±3.678

120.190±3.056

121.911±3.651

SE

30

101.556±3.650a

104.293±2.385 a f

93.025±4.503 a e

66.121±3.872 a e

113.507±5.736 a e

562.125

P < 0. 01

药物组

30

114.949±2.350 a c

113.195±2.376 a c

106.04±7.417 a c e

104.622±1.529a c e

116.669±3.526 a d

54.556

P < 0. 01

F

278.296

247.209

198.453

2613.021

27.629

P

P < 0. 01

P < 0. 01

P < 0. 01

P < 0. 01

P < 0. 01

    与对照组比较,a:P<0.01,与对照组比较,b:P<0.05,与SE组比较,c:P<0.01,与SE组比较,d:P<0.05,与同组2h时间点比较,e:P<0.01,与同组2h时间点比较,f:P<0.05

6    

    《伤寒论》146条中指出:“伤害六七日,发热、微恶寒、肢节烦痛、微呕、心下支结、外证未去者,柴胡桂枝汤主之。” 《伤寒论》对柴胡桂枝汤主症的描述与癫痫的症状相类似;而实际临床应用亦证实,柴胡桂枝汤是一种对癫痫有确切治疗作用的中医经典方剂[12]

    近年来临床及动物实验均表明,内质网应激参与了癫痫后神经元损伤[34]。内质网(endoplasmic reticulumER)对蛋白质的合成、翻译后修饰、折叠组装等起重要作用。当发生葡萄糖饥饿、缺氧、氧化还原状态的改变、钙离子稳态破环、蛋白糖基化修饰的抑制及突变蛋白表达等各种刺激时,都可能引起内质网功能障碍,导致内质网应激(ER StressERS)。ERS激活未折叠蛋白反应(unfolded protein responseUPR[5]使蛋白折叠能力提高、蛋白合成抑制以适应应激。因此,UPR是细胞对损伤的保护性反应[67]ER中含有促进凋亡的因子,如CHOPCaspase-12等;过度的ERSERS机制的异常,超过内质网UPR修复的能力,则加剧癫痫后神经系统的损害,ER则由促生存信号向促凋亡信号转换,引起细胞凋亡[8]。目前认为,UPR主要由跨膜蛋白所介导的三条信号转导途径组成,分别是ATF6PERKIRE1。其中,由IRE1介导的通路,既参与UPR[9],也参与ER应激引起细胞凋亡的途径[10]。因此,IRE1介导的通路尤为重要。

    本研究的实验结果显示,大鼠SE后,神经元凋亡的阳性细胞数随时间推移而增加;SE组大鼠的CHOP表达数量于2h出现增多,于4h时数量相对减少;于8h时数量再次上调,持续至24h出现峰值,随后开始减少;IRE1mRNA4h开始出现上调,于8h出现下调,持续至24h出现最低值,随后逐渐上调。与SE组不同的是,药物组大鼠IRE1mRNA8h时,表达仍持续上调,且4h8h24h表达较SE组明显增多(P<0.01);各时点CHOP数量表达、神经元凋亡的阳性细胞数较SE组均明显减少(P<0.01)。本实验结果表明,SE组大鼠SE后,于4h时出现前存活分子IRE1mRNA表达,提示ERS已激活;与此同时,出现前凋亡分子CHOP表达下调,提示ERS已激活UPR,启动了保护反应;随着缺血缺氧等损伤的发展,CHOP的表达持续上调,提示发生了过度的ERSERS机制的异常,加重了脑细胞的损伤;而药物组在应用柴胡桂枝汤后,IRE1mRNA能持续上调表达至8h,且各时点表达量较SE组明显增多,各时点CHOP数量表达、神经元凋亡的阳性细胞数较SE组均明显减少,考虑癫痫发作时,柴胡桂枝汤可能减少SE对内质网的刺激,上调前存活分子IRE1的表达,下调前凋亡分子CHOP的表达,减轻异常放电对脑组织的病理损害,发挥对神经元的保护作用。

    有实验研究表明[11]IRE1活性的维持可以提高内质网应激后细胞的生存率。如何应用柴胡桂枝汤预处理,维持IRE1的活性,减低内质网的压力,延长UPR的保护作用,可以作进一步的研究。

参考文献

[1]胡跃强,刘泰,祝美珍,等.中西医结合治疗癫痫40例临床观察[J].辽宁中医药大学学报,2009111:33-35.

[2]曾文长.柴胡桂枝汤加味治疗84例癫痫的临床观察[J].新中医,1990226:3-25.

[3]Yamamoto AMushy NSehindler CKet alEndo plasmie reticulum stress and apoptosis signaling in human temporal lobe epilepsy[J]J Neuro pathol Exp Neurol2006653):217225

[4]Jang YSKwon OJEndoplasmic reticulum stress response in kainic acid seiz ure model[J]Epilepsia200344Sup 9):3842

[5]DeGracia DJ Montie HL.Cerebra1ischemia and the unfolded protein response [J]. J Neurochem.200491:1-8.

[6]Heath-Engel HM.Chang NCShore GC.The endopla smic reticulum in apoptosis and autophagy: role of the BC L-2protein family[J].Oncogene20082750:6419-6433.

[7]Yoshida H.ER. stress and disease[J]FEBS J20072743:630-658

[8]Madeo F Kroemer G. Intricate links between ER stress and apopto sis[J]Mol Cell2009336):669-670

[9]Kohno K.How transmemb rane proteins sense endoplas mic reticulum stress[J]Antio xid Redox Signal2007912):2295-2303

[10]Wolfson JJMay KLThorpe CMet a1Subtilase cytotoxin activates PERKIREl and ATF6 endoplasmic reticulum stress-signalling pathways[J]Cell Microbi012008109):17751786

[11]Lin JH Li H Yasumura D et al.IRE1 signaling affects cell fate during the unfolded protein respond[J]. Science, 2007 3185852:944-949.

    *基金资助项目:2009年广西研究生教育创新计划资助,编号:2009106001006M17

 
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