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主管单位:内蒙古自治区食品药品监督管理局
主办单位:内蒙古自治区食品药品学会
编辑出版:北方药学编辑部
刊期:月刊
国内定价:每期12元 ,全年144元
创刊时间:2004年
国内统一刊号:CN15-1333/R
国际标准刊号:ISSN1672-8351
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实验研究
 
雾化吸入布地奈德对肺纤维化大鼠肺组织TGF-β和CTGF表达的影响研究 2018/10/22
   


雾化吸入布地奈德对肺纤维化大鼠肺组织TGF-β和CTGF表达的影响研究
梁瑞娟(濮阳市中医院  濮阳  457001)
摘要:目的:探讨雾化吸入布地奈德(BUD)对肺纤维化大鼠肺组织转化生长因子(TGF)-β和结缔组织生长因子(CTGF)表达的影响。方法:将45只SD大鼠随机分为3组:生理盐水空白对照组(NS组)、博来霉素模型组(BLM组)和布地奈德干预组(BUD组),并在处理后d7、d14、d28每组分别随机处死5只,苏木精-伊红(HE)和Masson染色对肺组织的肺泡炎及肺纤维化程度评分,酶联免疫吸附法(ELISA)测定肺泡灌洗液(BALF)中TGF-β、CTGF的浓度。结果:实验过程中,NS组大鼠均未发生肺泡炎和肺纤维化,BLM组和BUD组大鼠较NS组均发生肺泡炎和肺纤维化(P<0.05),BLM组大鼠的肺泡炎和肺纤维化均呈进行性加重,BUD组大鼠d7肺泡炎最为严重,随后开始好转,肺纤维化一直加重。NS组大鼠BALF中TGF-β和CTGF表达水平较低,BLM组和BUD组大鼠中各时间点的表达水平均显著高于NS组(P<0.05),且BUD组的表达水平显著低于BLM组(P<0.05)。结论:雾化吸入布地奈德,抗纤维化作用明显,显著降低大鼠肺组织TGF-β和CTGF表达水平。
关键词:雾化  布地奈德  肺纤维化  转化生长因子  结缔组织生长因子

Study on tge effects of aerosolized budesonide on the expression of TGF- β and CTGF in lung tissue of rats with pulmonary fibrosis
Liang Ruijuan(Puyang Hospita of TCM,Henan Puyang,457001)
Abstract:Objective: To investigate the effect of aerosolized budesonide (BUD) on the expression of transforming growth factor (TGF)-βand connective tissue growth factor (CTGF) in lung tissue of rats with pulmonary fibrosis.Methods: 45 SD rats were randomly divided into 3 groups: normal saline, blank control group (NS group), bleomycin model group (BLM group ) and budesonide intervention group (BUD group).After the treatment of 7d, 14d and 28d in each group,5 were randomly killed in each group.Hematoxylin eosin (HE) and Masson staining were used to grade lung tissue alveolitis and pulmonary fibrosis degree,and enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) was used to exam the TGF-β and CTGF concentration in bronchoalveolar lavage fluid (BALF).Results: During the course of the experiment, there were no alveolitis and pulmonary fibrosis in group NS group, while alveolitis and pulmonary fibrosis both occurred in group BLM and group BUD (P<0.05).The alveolitis and pulmonary fibrosis of the BLM rats were progressively aggravated.In BUD group, the alveolitis on the 7th day was the most serious, then began to improve, while the pulmonary fibrosis came worse.The expression levels of TGF-βand CTGF in BALF in NS group rats were lower, and the expression levels of BLM and BUD rats were significantly higher than that of NS group at each time point (P<0.05).And the expression level of BUD group was significantly lower than that of BLM group (P<0.05). Conclusion:Nebulized budesonide has obvious effect on anti-fibrosis and can significantly decrease the expredsion levels of TGF-β and CTGF in lung tissue of rats.
Key words:Atomization; budesonide; pulmonary fibrosis; transforming growth factor; connective tissue growth factor
肺纤维化是许多慢性肺疾病的共同结局,早期以肺泡炎表现为主,后期表现为成纤维细胞的病理性增生和细胞外基质(ECM)病理性聚集。目前,细胞因子是肺纤维化的研究热点,转化生长因子(TGF)-β和结缔组织生长因子(CTGF)是纤维化发生、发展的关键因子,两者关系密切[1]。布地奈德(BUD)是一种合成的糖皮质激素,具有抗纤维化作用,半衰期较短,毒副作用较小[2]。本研究采用雾化吸入BUD干预肺纤维化大鼠,观察BUD对肺纤维化大鼠TGF-β和CTGF表达的影响。
1材料与方法
1.1材料及试剂:健康清洁级SD大鼠45只,体重180~200g,由上海斯莱克实验动物有限公司提供。博莱霉素(日本化药株式会社,H20090885);BUD(瑞典阿斯利康制药有限公司,H20110259);大鼠TGF-β、CTGF酶联免疫吸附法测定试剂盒(武汉伊莱瑞特生物科技股份有限公司);Bio-Rad酶标仪(美国Bio-Rad公司),其他常用试剂均为国产分析纯。
1.2方法
1.2.1动物分组:健康清洁级SD大鼠45只,实验条件下饲养一周,按照随机数字表法分为3组:博来霉素模型组(BLM组)、生理盐水空白对照组(NS组)、布地奈德干预组(BUD组),每组15只。
1.2.2肺纤维化模型的建立及药物干预:BLM组和BUD组气管内灌注博莱霉素诱导肺纤维化,NS组在相同条件下灌注生理盐水(NS)。10%水合氯醛(3ml/kg)腹腔注射麻醉大鼠,暴露气管后,注射液体并立即将动物直立、旋转,使液体在肺内均匀分布。0~6d,每天雾化一次,BUD组雾化吸入BUD(BUD 0.15mg/kg,NS 3 ml),BLM组和NS组雾化吸入3ml NS,d7、d14、d28每组分别处死动物5只。
1.2.3雾化方式:将大鼠放入除去底盖的矿泉水瓶,让大鼠将头伸出瓶颈,尾部堵上,进行超声波雾化,每雾化3~5min,休息1~2min,需雾化40min左右。
1.2.4肺组织标本的留取和组织学分析:处死动物后,经右心室注入4℃ NS冲洗肺脏,并收集支气管肺泡灌洗液(BALF)。向左肺支气管内注入4%多聚甲醛,固定液进行固定。石蜡包埋后切片,进行苏木精-伊红(HE)染色和Masson染色。右肺放入-80℃冰箱保存备用。对大鼠肺泡炎及肺纤维化程度评分时,标准如下:无肺泡炎或肺纤维化,1分;轻度肺泡炎或肺纤维化,2分;中度肺泡炎或肺纤维化,3分;重度肺泡炎或肺纤维化,4分。
1.2.5酶联免疫吸附法(ELISA)测定BALF中TGF-β和CTGF的浓度
采用ELISA法测定BALF中TGF-β和CTGF的浓度,具体方法参照试剂盒说明书。
1.3统计学方法:所有数据由SPSS 22.0进行分析,计量资料以“均数±标准差”( ± s)表示,采用t检验;P<0.05为差异具有统计学意义。
2结果
2.1各组大鼠的肺泡炎和肺纤维化程度变化:NS组大鼠各时间点肺组织均未见肺泡炎和肺纤维化的发生。BLM组和BUD组大鼠均发生肺泡炎和肺纤维化,且较NS组均有显著差异(P<0.05);BLM组大鼠d7表现出明显的肺泡炎症和肺间质炎症,d14时肺泡炎症仍较重,开始出现纤维化病变,d28时,肺泡结构遭到破坏,间质增生,形成广泛纤维化;与BLM组比较,BUD组大鼠雾化吸入BUD处理后,各时间点大鼠的肺泡炎症均有所改善(P<0.05),肺纤维化程度降低(P<0.05)。各组大鼠的肺泡炎和肺纤维化评分详见表1。
表1 各组大鼠肺泡炎和肺纤维化情况比较( ± s, 分)
 
组别 7d(n=5) 14d(n=5) 28d(n=5)   
 肺泡炎(分) 肺纤维化(分) 肺泡炎(分) 肺纤维化(分) 肺泡炎(分) 肺纤维化(分)   
NS组 1.20±0.55 1.00±0.00 1.00±0.00 1.00±0.00 1.00±0.00 1.00±0.00   
BLM组 3.80±0.60* 2.40±0. 55* 3.40±0.50* 3.40±0.55* 2.40±0.40* 4.20±0.60*   
BUD组 2.40±0.45*# 1.60±0.50*# 2.20±0.40*# 2.40±0.60*# 1.80±0.50*# 3.20±0.65*# 
注:与NS组比较,*P<0.05;与BLM组比较,#P<0.05。
2.2各组大鼠BALF中TGF-β和CTGF表达水平比较:ELISA法显示BALF中TGF-β和CTGF在NS组大鼠中均为弱表达,在BLM组和BUD组大鼠中各时间点的表达水平均显著高于NS组(P<0.05),BUD组大鼠BALF中各时间点TGF-β和CTGF表达量较BLM组显著减少(P<0.05)。各组TGF-β的表达量在d7达到最大,随后逐渐减少;CTGF的表达量在d14达到最大后开始降低,详见表2。
表2 各组大鼠BALF中TGF-β和CTGF表达水平比较( ± s, pg/ml)
 
组别 7d(n=5) 14d(n=5) 28d(n=5)   
 TGF-β(pg/ml) CTGF (pg/ml) TGF-β(pg/ml) CTGF (pg/ml) TGF-β(pg/ml) CTGF(pg/ml)   
NS组 8.24±1.19 114.31±3.39 8.37±1.36 116.83±4.05 8.72±0.51 115.26±6.29   
BLM组 58.74±5.67* 152.68±4.10* 44.19±4.25* 175.35±5.83* 30.63±1.56* 134.52±1.97*   
BUD组 33.42±1.63*# 135.29±4.06*# 22.52±1.68*# 153.07±5.94*# 18.29±2.53*# 125.63±5.73*# 
注:与NS组比较,*P<0.05;与BLM组比较,#P<0.05。
3讨  论
目前,肺间质纤维化的发病机制仍不十分明确,早期常表现为肺泡炎,肺泡内有大量炎症细胞浸润,随后在炎症细胞的参与下,各种细胞因子和炎性介质大量释放,扩大了组织损伤,引起肺间质增生,导致肺纤维化[3~4]。TGF-β与CTGF被公认为在肺间质纤维化的发生、发展过程中发挥了重要作用。
TGF-β是肺纤维化研究中认识最早的细胞因子,参与肺损伤的伤口修复过程,同时还参与CTGF转录的调控;CTGF则是组织修复加强肺纤维化过程中的重要因子,其基因表达可促进ECM合成,并在肺纤维化形成过程中起重要作用,TGF-β和CTGF的过表达,往往促进肺纤维化的形成[5~6]。本研究中使用ELISA法检测BALF中TGF-β与CTGF的含量,结果表明,NS组BALF中TGF-β与CTGF表达量较少,BLM组BALF中TGF-β与CTGF水平显著增加(P<0.05),对应时间点的BUD组大鼠BALF中TGF-β与CTGF水平较BLM组显著降低(P<0.05);实验过程中,BUD组肺泡炎程度在造模后d7达到高峰,随后降低,与TGF-β和CTGF的表达水平具有一定的相关性,但肺纤维化程度一直进行性加重,提示肺纤维化大鼠应用BUD早期效果较好,推测雾化吸入BUD可早期抑制炎症反应,抑制细胞因子的生成,减少炎症介质的释放,降低TGF-β和CTGF的表达水平,减轻博莱霉素对肺组织的致纤维化作用,缓解肺间质纤维化的发生和发展,但不能完全阻止肺纤维化的发展[7~8]。
博莱霉素气管内注入复制肺纤维化动物模型是肺纤维化研究中常用的造模方法,其病理组织学改变与临床的肺纤维化具有相似性。本研究利用博莱霉素复制了大鼠肺纤维化模型,经HE和Masson染色验证,病理学特征与文献中报道的一致[9],表明动物模型复制成功。目前,治疗肺纤维化仍以糖皮质激素为主,BUD是目前唯一非卤素的吸入糖皮质激素,无含氟药物的不良反应,同时具有良好的亲脂性,局部抗炎效果较好[10],采取雾化吸入给药方式,可快速直接作用于呼吸道,形成肺内局部高浓度,发挥抗炎功效,且所用剂量较全身用药量少,可大大减少全身使用激素导致的副作用[11]。
综上所述,雾化吸入布地奈德具有显著的抗纤维化作用,减少肺纤维化大鼠肺组织TGF-β和CTGF表达,有望成为临床安全有效抗纤维化用药的最佳选择之一。
参考文献
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